2 结果与分析

　　2.1 栗实内生细菌初步鉴定情况

　　从罗田板栗玫瑰红栗实中共分离出2株内生细菌，分别编号为FR1和FR2。其中，细菌FR1菌落圆形、边缘齐整、表面湿润，菌落不透明，呈灰白色，菌体杆状，革兰氏染色为阴性（图1A）；能产生精氨酸水解酶（图1B）；甲基红反应为阳性（图1C）；氧化酶试验阳性（图1D）；不具有明胶酶，不能水解明胶（图1E）；能分解葡萄糖，乙酰甲基甲醇反应为阳性，产生红色化合物（图1F）；可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，出现绯红色阳性反应（图1G），但没有氮气放出；能产生苯丙氨酸脱氨酶，加入三氯化铁试剂后产生绿色化合物（图1H），初步鉴定FR1为拉恩氏菌属（Rahnella sp.）。

　　内生细菌FR2菌落扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，菌落直径2～3 mm，菌体呈杆状、单生，革兰氏阳性菌（图2A），产生游离椭圆形芽孢（图2B），初步鉴定FR2为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。

　　2.2 栗实内生细菌16S rDNA序列分析结果

　　利用16S rDNA通用引物27F和1 492R从分离得到的2株内生细菌的基因组中扩增出的DNA片段长度为1 000～2 000 bp（图3），扩增出的PCR产物经纯化进行DNA测序，结果表明FR1、FR2的序列长度分别为1 400、1 038 bp。序列提交GenBank数据库进行BLAST比对，将FR1、FR2菌株的16S rDNA序列与GenBank中的序列进行比较发现，与FR1同源性最高的菌为拉恩氏菌属，与FR2同源性最高的是芽孢杆菌属。将FR1、FR2序列与数据库中同源性较高的几个菌株进行比较，并用ClustalX进行多序列比对、用MEGA 5.1软件中的邻接法构建系统的进化树（图4）。结果表明FR1的16S rDNA序列与细菌Rahnella aquatilis KC351183.1的序列同源性高达97%，从系统发育树可以看出，FR1与Rahnella aquatilis KC351183.1聚为一簇，该结果支持初步鉴定的结果。综合FR1的形态、生理生化特征和16S rDNA的序列分析结果，将FR1鉴定为水生拉恩菌；从系统发育树可以看出FR2与Bacillus licheniformis EU221362.1聚为一分支，FR2的16S rDNA序列与Bacillus licheniformis EU221362.1的序列同源性高达98%，该结果支持初步鉴定结果，综合FR2的形态、生理生化特征和16S rDNA的序列分析结果，将FR2鉴定为地衣芽孢杆菌。

　　3 小结与讨论

　　板栗储藏过程中发生腐烂是一个复杂的过程，其中，致病菌的侵染是其主要原因。本研究从罗田板栗玫瑰红中分离到2株菌株，通过生理生化特征初步鉴定为拉恩氏菌属和芽孢杆菌属，结合其16S rDNA的序列分析结果，将2株菌株分别鉴定为水生拉恩菌、地衣芽孢杆菌。

　　有资料显示，拉恩氏菌属属于肠杆菌科，广泛分布于水、土壤、植物根际及蜗牛体内，偶尔能在食品、种子和临床微生物样本（伤口、肠胃病患者粪便、败血症患者体内）中发现；但目前尚未能明确其致病性。有研究认为，某些拉恩氏菌属菌株具有抑菌性，能够作为植物病害生防菌[14]。芽孢杆菌属在自然界分布非常广，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。其中，地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具有应用潜力的菌种之一，在医药、饲料加工、农药等行业取得了较多的研究成果[15，16]。这2株菌株在板栗果实中的具体作用还有待进一步研究。

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